ประสิทธิภาพที่สูงของการผลิต protoplasts และการงอกกลับใหม่จาก hyphal bodies ของเชื้อราที่ใช้ในการควบคุมศัตรูพืช Nomuraea rileyi สายพันธุ์ MJ

  • จันทร์เพ็ญ วิวัฒน์ ปิยาภรณ์ สุภัคดำรงกุล

Abstract

กระบวนการเตรียม protoplasts ให้ได้ปริมาณที่มาก และปริมาณการงอกกลับใหม่ที่สูงจาก Nomuraea rileyi สายพันธุ์ MJ ซึ่งคัดแยกจากตัวอ่อนของหนอนกระทู้ผัก Spodoptera โดยการเก็บตัวอย่างที่จังหวัดเชียงใหม่จะถูกบรรยาย ปริมาณ protoplasts ที่สูงได้จากการนำ hyphal bodies อายุ 3 วัน ของ N. rileyi ซึ่งเพาะเลี้ยงในอาหารเพาะเชื้อเหลว Sabouraud maltose โดยมี yeast extract ที่ความเข้มข้น 2 เปอร์เซ็นต์ เป็นส่วนผสม (SMY) ทำการ pretreatment เชื้อโดยการบ่มกับ dithiothreitol ก่อนการย่อยสลายด้วยเอนไซม์ที่เหมาะสม ซึ่งประกอบด้วย -glucuronidase ความเข้มข้น 10 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร และเอนไซม์ chitinase ที่ได้จาก Bacillus circulans No.4.1 จำนวน 8 ยูนิต ละลายใน phosphate buffer ที่ความเข้มข้น 0.1 โมลาร์ พีเอช 6.0 และ mannitol ที่ความเข้มข้น 0.8 โมลาร์ โดย protoplasts ที่ผลิตได้พบว่า มีความถี่ในการงอกกลับใหม่สูงถึง 98 เปอร์เซ็นต์ เมื่อ mannitol ที่ความเข้มข้น 0.5 โมลาร์ ถูกใช้เป็น osmotic stabilizer ในอาหารเพาะเชื้อ วิธีการเบื้องต้นนี้จะประยุกต์ใช้ในการศึกษาทางพันธุศาสตร์ของเชื้อ N. rileyi โดยวิธีการหลอมรวมกันของ protoplasts และการถ่ายทอดยีนโดยวิธีการทรานส์ฟอร์เมชัน

References

1. Kelkar HS, Shankar V, Deshpande MV. Rapid isolation and regeneration of Sclerotium rolfsii protoplasts and their potential application for starch hydrolysis. Enzyme Microb Technol 1990;12:510-4.
2. Sandhu DK, Wadhwa V, Bagga PS. Use of lytic enzymes for protoplasts production in Trichoderma reesei. Enzyme Microb Technol 1989;11:21-5.
3. Anne′ J, Okawa K, Wood TM. Studies on the preparation and regeneration of protoplastss from the cellulolytic fungus Penicillium pinophilum. Enzyme Microb Technol 1986;9:527-32.
4. Schupp T, Divers M. protoplasts preparation and regeneration in Nocardia mediterranei. FEMS Microbiol Lett 1986;36:159-62.
5. Zhang H, Shinkawa H, Ishikawa J, Kinashi H, Nimi O. Improvement of transformation system in Streptomyces using a modified regeneration medium. J Ferment Bioeng 1997;83:217-21.
6. Silveira WD, Azevedo JL. Protoplasts fusion and genetic recombination in Metarhizium anisopliae. Enzyme Microb Technol 1987;9:149-52.
7. Pfeifer TA, Khachatourians GG. Beauveria bassiana protoplasts regeneration and transformation using electroporation. Appl Microbiol Biotechnol 1992;38:376-81.
8. Cheng Y, Be′langer RR. Protoplasts preparation and regeneration from spores of the biocontrol fungus Pseudozyma flocculosa. FEMS Microbiol Lett 2000;190:287-91.
9. McCoy CW, Sawson RA, Boucias DG. Microbial insecticides, part A: entomogenous protozoa and fungi. In: Ignoffo CM, editor. CRC handbook of natural pesticides. Boca Roton Florida: CRC Press; 1988. p. 151-236.
10. Boucias DG, Bradford DL, Barfield CS. Susceptibility of the velvetbean caterpillar and soybean looper (Lepidoptera: Noctuidae) to Nomuraea rileyi: effects of pathotype, dosage, temperature and host age. J Econ Entomol 1984;77:247-53.
11. Goosen T, Bos CJ, van den Broek HWJ. Transformation and gene manipulation in filamentous fungi. In: Arora DK, Elander RP, Mukerji KG, editors. Handbook of applied mycology. New York: Marcel Dekker; 1992. p. 151-95.
12. Butt TM, Beckett A, Wilding N. Protoplastss in the in vivo life cycle of Erynia neoaphidis. J Gen Microbiol 1981;127:417-21.
13. Tyrrell D. Occurrence of protoplastss in the natural life cycle. Exp Mycol 1977;1:259-63.
14. Boucias DG, Penland JC. Production and regeneration of protoplasts in the entomogenous hyphomycete Nomuraea rileyi. J Invertebr Pathol 1984;43:285-7.
15. Liu W, Zhu WM. Production and regeneration of Trichosporon cutaneum protoplasts. Proc Biochem 2000;35:659-64.
16. Wiwat C, Siwayaprahm P, Bhumiratana A. Purification and characterization of chitinase from Bacillus circulans No.4.1. Curr Microbiol 1999;39:134-40.
17. St. Leger RJ, Shimizu S, Joshi L, Bodochka MJ, Robert DW. Co-transformation of Metarhizium anisopliae by electroporation or using the gene gun to produce stable GUS transformants. FEMS Microbiol Lett 1995;131:289-94.
18. Davis BD. Factors affecting protoplasts isolation. In: Peberdy J, editor. Fungal protoplasts application in biochemistry and genetics. New York: Marcel Dekker; 1985. p. 45-72.
19. Lalithakumari D. Protoplasts-a biotechnological tool for plant pathological studies. Indian Phytopathol 1996;49:199-212.
20. Collings A, Davis S, Mills J. Factors affecting protoplasts release from some mesophilic, thermophilic and thermotolerant species of filamentous fungi using Novozyme 234. J Microbios 1988;53:197-210.
21. Wang J, Holden DW, Leong SA. Gene transfer system for the phytopathogenic fungus Ustilago maydis. Proc Natl Acad Sci USA 1988;85:865-9.
22. Richards WG. An enzyme system to liberate spore and mycelial protoplasts from a dimorphic fungal plant pathogen Ophistoma ulmi (Buism.) Nannf. Physiol Mol Plant Pathol 1994;44:311-9.
23. Peberdy JF. Fungal protoplastss. In: Bennett JW, Lasure LL, editors. More gene manipulations in fungi. California: Acadamic Press; 1991. p. 307-18.
Published
2018-02-26
How to Cite
วิวัฒน์ ปิยาภรณ์ สุภัคดำรงกุล, จันทร์เพ็ญ. ประสิทธิภาพที่สูงของการผลิต protoplasts และการงอกกลับใหม่จาก hyphal bodies ของเชื้อราที่ใช้ในการควบคุมศัตรูพืช Nomuraea rileyi สายพันธุ์ MJ. วารสารวิทยาศาสตร์และเทคโนโลยี หัวเฉียวเฉลิมพระเกียรติ (ผ่านการรับรองคุณภาพอยู่ในฐานข้อมูล Thai-Journal Citation Index (TCI) กลุ่มที่ 1), [S.l.], v. 3, n. 2, p. 7-17, feb. 2018. ISSN 2408-266X. Available at: <http://scijournal.hcu.ac.th/ojs/index.php/scijournal/article/view/116>. Date accessed: 17 oct. 2018.